Buonasera a tutti. Grazie di essere collegati per. Chi non mi conosce? Sono fiorilapatiri e sono la referente per l'Italia per Blueprigie Genetics. Blueprint è un'azienda internazionale che è presente in 70 paesi al mondo. È composta da diversi team che sono tutti impegnati nel sviluppare degli approcci diagnostici per le malattie genetiche, per dare le opportunità ai mezzi a. I clinici e ai pazienti di conseguenza. Per per facilitare la loro pratica clinica quotidiana. Alla fine di questo, di questo evento, siete liberi di di porre le vostre domande in altro, trovate la la sessione questions and alceser dove potete mettere tutti i quesiti che vengono in mente durante la presentazione e alla fine cercheremo. Cercheremo di rispondere AA tutte le domande che sono state poste. L'evento di oggi sarà presentato da da dottor Diego cortese. Che fa parte del nostro team di interpretazione clinica. Lavora in Blue Pride dal 2021, è italiano ma è residente in in Svezia. Lui, in particolare, fa parte del team che si occupa della. Del team cardiologico di cardiologia di oftalmologia è l'interpretazione delle varianti, su. Sui familiari. Cui se non ci sono. Particolari difficoltà? Io passerei la parola a Diego, così dopo noi ci risentiamo alla fine della presentazione se ci sono domande. Va bene, perfetto, grazie. Grazie per la presentazione fiorirà. Io sono molto contento di essere qui AA presentare questo webinar perché è il primo in italiano EE quindi mi mi rende orgoglioso. Mi hai già presentato, quindi salto la mia introduzione. Aggiungo solo da parte della diciamo brevemente sull'azienda che abbiamo un'offerta che va dal dalla singola variante fino alle somma completo e da parte dell'esome è quella su cui ci focalizzeremo oggi. La sessione è divisa in due parti, la prima parte sul ruolo dell'esoma completo nel percorso del del paziente e una seconda parte invece legata all'integrazione del DNA mitocondriale nelle zooma completo. Dunque, cosa intendiamo con enzoma completo? A differenza dell'esoma clinico, dove andiamo a sequenziare solo i geni già associati a malattia nell'esoma completo sequenziamo tutte le regioni codificanti di tutti i geni conosciuti che sono all'incirca 20.000 corrisponde più o meno all'uno 2% del DNAE. Cercherò di illustrarvi perché questo sia uno strumento diagnostico molto potente per per i pazienti. Dunque, nella nostra esperienza l'esoma completo viene scelto quando ci sono dei fenotipi complessi, quando c'è una diagnosi clinica incerta e quando EO quando ci sono dei test genetici che sono stati eseguiti in precedenza ma hanno dato un esito inconclusivo. Oppure negativo. Chiaramente la diciamo la ciò che può succedere è abbastanza frequentemente è che si sia passati prima attraverso 1 1, pannello che però non era diciamo non poteva essere conclusivo proprio per la limitazione del numero di geni, oppure quando esiste una presentazione atipica o quando è richiesta una nuova associazione gene malattia che. Non è stata trovata in precedenza. Questa slide vi illustra un po quella che è la nostra ricetta diciamo per 1 1 esoma ottimizzato. E durante la presentazione andremo a toccare tutti questi vari punti, quindi io comincerei proprio con parlare dei benefici legati ad eseguire questo West trio, ovvero il sequenziamento non solo del probando ma anche dei genitori. Allo stesso tempo, questo perché ci permette di facilitare l'interpretazione e. In maniera molto chiara, ad esempio, di identificare varianti de novo direttamente, senza dover ricorrere poi a test addizionali nella famiglia. Ricordo che questo rappresenta circa il 50% delle diagnosi. Invece, in una situazione di ereditarietà recessiva possiamo direttamente determinare la fase delle varianti, anche in questo caso, quindi, possiamo essere molto più veloci nel nel fornire una diagnosi molecolare e informare quindi del del rischio di ricorrenza in famiglia. Questo ovviamente ci porta ad avere una classificazione più accurata di tutte le varianti. Come detto questa è una presentazione con un focus abbastanza clinico, quindi andiamo a vedere subito un caso di un bambino di di età inferiore ad un anno con ritardo psicomotorio ipotonia una lieve di dismorfia e nessuna storia familiare. È stato ordinato un westrio e nel provando abbiamo identificato 5 anni. Varianti. In 5 geni diversi, tutte associate a malattie autotonica dominante e tutti, bene o male, associati. Al al fenotipo, quindi tutti associati al ritardo psicomotorio. La maggior parte associati a ipotonia e tutti associati a dismorfia, tutte varianti rare, quindi non poteva essere escluso nulla sulla base delle frequenze e. Con dei valori derivanti dall'analisi in silico anche, diciamo, abbastanza variabili. Però non in grado di permetterci di di di selezionare nulla, questo. Quindi questo nel singolo propando avrebbe portato. Portato, diciamo, una necessità di testare ulteriormente nella famiglia, mentre grazie. Grazie al al fatto che abbiamo eseguito 1 1 trio direttamente. La abbiamo identificato la variante in km to a direttamente come De Novo e quindi siamo riusciti a refertarla insieme ovviamente al ad altro tipo di di evidenza che abbiamo raccolto per questa variante. Direttamente, come probabilmente patogenica. Quindi questo ci ha permesso di identificare direttamente una variante, una variante de nuovo e informare, meglio quindi la consulenza. Direttamente, per portare poi a un'interpretazione facilitata e un reperto semplificato. Andando a vedere che cos'altro facciamo per ottimizzare il il nostro Enzo ma completo. Sicuramente. È determinante il fatto di includere anche varianti non codificanti, che sono però anche clinicamente rilevanti, o almeno le regioni in cui queste varianti si trovano. Tipicamente le varianti causative note si trovano all'interno degli esoni. E molti protocolli vanno a sequenziare intorno agli esoni queste famose 20 paia di basi. Però in base alla nostra esperienza abbiamo visto che è importante anche andare a sequenziare delle regioni offshore, che però presentano alcune varianti che sono già note clinicamente, perché in quelle regioni potrebbero esserci effettivamente altre varianti importanti per la diagnosi del del paziente. Così come anche in regioni promoter o i file prime UTRI3 prime TR. Quindi come facciamo questo? Beh, ovviamente tenendoci a fuori. Aggiornati rispetto alla letteratura e aggiungendo questi primer addizionali per regioni molto specifiche e. Questo ci permette di eseguire un'interpretazione più facile rispetto a quelle varianti che sono clinicamente rilevanti. Alcune sono già descritte in letteratura e altre saranno nella prossimità. Quindi questo ci dà un'idea del fatto che la variante nuova del paziente potrebbe anche essere importante. Al momento identifichiamo quasi 2000 varianti di questo tipo. E rappresentano un po più dell'uno percento delle delle diagnosi in esoma, quindi è un dato credo che sia andato abbastanza importante. Quindi vi presento questo dato con un questo caso con un bambino con distrofia muscolare, anche qui mesomo a trio da genitori sani. E qui possiamo vedere. No, uno spezzato del del gene corsi XA One, dove siamo andati a identificare una variante abbastanza lontana dalle dalle regioni codificanti una. Una variante associata a una malattia autotonomica dominante e grazie alle somma trio siamo riusciti direttamente a determinarla come come de nuovo. Quindi se fossimo rimasti solo nella regione codificante o appena fuori dal dall'ESOME dagli dagli esoni non avremmo identificato questa variante, però grazie al seeding con gli conucleotidi specifici l'abbiamo vista quindi. Quindi questo ci ha permesso di dare una diagnosi in tempi più rapidi. Una diagnosi, ma anche abbastanza inaspettata rispetto a questo tipo di variante e di identificare anche un diciamo il rischio di ricorrenza e informare meglio la consulenza genetica, quindi qui aver inserito varianti non codificanti però clinicamente rilevanti ha fatto la differenza. Poi vi vorrei parlare della della parte di analisi delle delle azioni duplicazioni non bilanciate. E dell'interpretazione, diciamo così, esperta rispetto a questo tipo di varianti. L'analisi di cien VIS, particolarmente complessa proprio perché si basa sul almeno in NGS, si basa sulla mappatura del coverage, quindi il livello di normalizzazione deve essere molto buono EE poi la mappatura essenzialmente si esegue su sulla differenza tra le reads che vengono osservate rispetto a quelle attese e poi quando c'è una differenza significativa si fa il calling della variante. Nella nostra esperienza i kit standard per i bioinformatici standard per chiamare questo tipo di varianti non sono sempre. Sufficienti per identificare tutte le varianti? Così abbiamo integrato la nostra analisi con un algoritmo in House. Qui chiamato Small deals, che riesce a identificare. Delle azioni duplicazioni fino al ad un le zone soltanto. Quindi questo è un po il nostro ponte, diciamo fra l'analisi di varianti puntiformi o indels e cnvis più grandi, e poi abbiamo un'altro tipo di analisi dei Drake points che ci permette di identificare chiaramente quali siano le coordinate delle delle varianti. Ovviamente il prerequisito per un'analisi di c and bis corretta è di avere un coverage elevato regionale anche. Ma anche 1 1 buona profondità e questo abbiamo visto che fare differenza, principalmente perché il segnale può essere ben uniformato. E qui il nostro dato è che un esoma su 7 ha un finding diagnostico in c and vis e di questi il 10% sono più piccoli di una kilo base, quindi l'avere nostro strumento in House per questo tipo di analisi ci permette di identificare delle varianti che altrimenti perderemo. In questo in questo caso questo è un caso di un feto deceduto che presentava anomalie multiplemento. Accorciamento delle ossa lunghe micrognazia. Avevano eseguito già un pannello per displasie scheletriche, era negativo e quindi si è si è proceduto all'esomatrio. Qui il feto aveva una situazione di eterozigosi composta per due varianti, identificate nei nei genitori, nel padre la una S and B già classificata come patogenica, e poi una delezione invece su singole zone nello stesso genere da parte della madre. E in questo caso quindi si diciamo, l'associazione era quella con un disturbo congenito della della glicosilazione. E qui la difficoltà per. La parte interpretativa è non dare a capire se queste zone, diciamo la direzione di queste zone, avesse effettivamente 1 1 importanza oppure no, e quindi abbiamo visto che esistevano diversi tipi di di pubblicazioni negli anni rispetto all'associazione del gene con il Fenotipo che avevano. Diciamo Espanso il lo spettro clinico rispetto ovviamente alle ai finding iniziali e quindi noi osservavamo nel feto un fenotipo severo di di questo disturbo congenito. Però queste zone detto e zone e nel gene composto da 37 aminoacidi, quindi. Relativamente piccolo. E complesso da interpretare perché si tratta di una zona in Frame, quindi non ci dice direttamente che la proteina viene viene troncata e rappresentava solo il meno del 5% della proteina, quindi anche qui un dato difficile da da interpretare da solo però. Eravamo in grado di identificare alcune varianti all'interno del di queste zone, almeno una di queste varianti sembrava essere, diciamo era associata in modo chiaro alla patologia allo stesso tipo di fenotipo. E quindi questo ci ha permesso di diciamo di procedere alla classificazione e di considerare una serie di cose, come il match del fenotipo che era molto buono, il fatto che le zone fosse funzionalmente rilevante. Che la frequenza di di questa variante fosse bassa, insomma da essere in linea con il tipo di il tipo di patologia e che si trovasse in trance con un'altra variante patogenica. Quindi tutto considerato. Siamo riusciti a dare poi una diagnosi molecolare di di patologia associata ASOG five. Con un 25% di rischio di ricorrenza. In questo caso? Ha fatto la differenza il fatto di riuscire a identificare 1 1. C and B così piccola? Ehm. Che ovviamente poi è stata confermata anche con digital choplex PCR, però poi siamo riusciti anche a interpretarla in modo in modo corretto proprio grazie a una diciamo un'investigazione estensiva della letteratura EE di tutto il tipo di evidenza che che abbiamo ovviamente aiutato dal fatto che avessimo per eseguito l'esoma anche sui genitori. Per quanto riguarda invece il punto sulle associazioni tra geni e malattie, questo è un punto molto importante che. Spesso trova diciamo anche delle delle differenze tra i diversi laboratori. EE modi di modi di ragionare però ecco diciamo che noi ci basiamo sulle raccomandazioni fornite da da clingen che però. Al momento non ha un catalogo completo di di associazioni igieni malattia e comunque facciamo anche noi poi lo stesso tipo di di analisi per vedere se raggiungiamo la stessa associazione di klingen. Insomma, sappiamo che. È fondamentale, nel momento in cui si si fa un esoma completo, riuscire ad avere una associazione igiene malattia aggiornata, perché molto spesso andiamo a identificare varianti su su geni non ancora associati a malattia e. E quindi poi eseguiamo questo tipo di di analisi proprio per andare a capire se l'evidenza può essere limitata, emergente, moderata EE così via vari tipi di di associazione. Come potete vedere in questo, in questa figura vanno da da rifiutata a stabilita e. Quindi l'analisi poi dell'Esoma si focalizza essenzialmente sui geni con un'associazione almeno moderata. Però diciamo che anche geni. Laddove non ci sia ancora un'associazione. Moderata, però presentano una serie di caratteristiche che fan pensare a una variante importante per il fenotipo del paziente. Possono essere anche riportate. Quindi questo è un caso di un di un giovane adulto che ha sofferto molto improvvisa e poi alla. All'autopsia è stata identificata una cardiomiopatia dilatativa e è stato eseguito un esoma da anche trio da genitori sani. Questo paziente era eterozigote composto per due varianti su NRIP1, variante ereditata dal padre, una variante troncante, mentre l'altra variante era una variante missence. E quando siamo andati a capire se ci fosse un'associazione possibile tra questo gene e la cardiomiopatia, diciamo. Ci siamo scontrati col fatto che nessuno. Ciofino Type né klingen avessero ancora pubblicato nessuna evidenza rispetto a questo rispetto a questo gene, quindi. Cosa abbiamo fatto? Abbiamo consultato il nostro database interno e siamo riusciti a identificare 11 pro bandi non imparentati, tutti con. Cardemiopatia dilatativa. E varianti di alleliche su e rap. Così siamo riusciti a identificare un arricchimento significativo di queste varianti nei pazienti con la cardiomiopatia dilattativa e anche con un modello poi no-cout di geografish siamo riusciti a modellare il fenotipo cardiaco. Quindi la associazione gene-malattia che. Non esisteva ancora, diciamo in letteratura. Siamo riusciti a siamo riusciti a farla e non solo, ma siamo riusciti anche a dare un'associazione igiene malattia forte. Quindi questo ci ha permesso poi di classificare entrambe le varianti. Ereditate dei genitori come patogeniche e quindi arrivare a una diagnosi chiara di di malattia associata a entrapp su su questo individuo quindi un 25% di di rischio per i vari Sibling EE. Qui diciamo che siamo orgogliosi del fatto di essere riusciti a fare un lavoro per. Creare questo tipo di di studio per avere un'associazione, igiene e malattia aggiornata e puntuale per questo paziente. Quindi diciamo che la nostra ricetta, se così vogliamo chiamarla per per un esoma completo, consiste proprio già nella strategia, nel. Cercare di scegliere, quando possibile, un westrio perché informa bene rispetto a varianti di now, wallpasing e altro tipo di informazioni. Ovviamente ci sono delle caratteristiche tecniche da rispettare, come il coverage elevato e uniforme regionale e anche di profondità puntuale. L'inclusione di regioni non codificanti clinicamente rilevanti, quindi su tutta la regione, in modo da andare a identificare anche altre varianti non ancora note pure in quelle regioni che potrebbero essere rilevanti un'interpretazione. Esperta e puntuale, diciamo umana. Umana e che che richieda tempi. Tempo e una certa expertise, così come anche una, diciamo una detenzione ottimizzata di copy number variation. Anche con kit customizzati, proprio per cercare di andare a identificare quelle varianti più difficili che non sono grandi delezioni e non sono varianti puntiformi o inders, ma stanno un po nel mezzo. Avere delle associazioni igiene e malattia aggiornate e quando non esistono essere in grado di di crearle e poi come ultimo punto l'inclusione del del genoma mitocondriale, e questo ci porta direttamente alla alla seconda parte del di questa presentazione, quindi oltre il DNA nucleare, come combinare insomma completo con l'analisi del mitocondriale e come questo abbia fatto la differenza per alcuni dei nostri, dei nostri pazienti? Molto brevemente, non sto a soffermarmi molto su che cosa siano le malattie mitocondriali, però possiamo proprio brevemente dire che sono un gruppo di patologie causate da difetti nella catena respiratoria del mitocondrio e quindi si caratterizzano per un deficit di produzione di energia che poi. Diciamo si si nota molto nel coinvolgimento multisistemico e nella variabilità fenotipica, che sono due caratteristiche che generano molta complessità e difficoltà nel. Nell'interpretazione clinica delle varianti mitocondriali. Qui possiamo vedere alcuni esempi di. Diciamo di associazione con diversi organi, quindi andiamo da tassì a emicrania, ictus per la parte cerebrale, cardiomiopatie, miopatie, debolezza muscolare, patologie renali, epatiche, sordità, neuropatie ottiche e retinopatie quindi? C'è davvero una variabilità clinica molto elevata proprio derivante dal dal coinvolgimento multisistemico. Ed è bene ricordare che le patologie mitocondriali non sono legate solo al DNA mitocondriale, in sé che ereditarietà Matri lineare, ma anche da varianti su dna nucleare, quindi varianti. Geni coinvolti nel mantenimento del DNA mitocondriale e nelle direzioni del mitocondriale, quindi. Tipicamente in una malattia mitocondiale con con variante su Mitocondiale ci si aspetta un certo tipo di storia familiare, mentre nel nucleare ci possono essere diversi tipi di di ereditarietà che vengono che vengono attesi dall'autosomica recessiva dominante OO Xlint. Di nuovo brevemente, giusto per dare un'idea del di cosa sia Genova mitocondriale, se qualcuno non è, diciamo non lavora col mitocondriale quotidianamente, si tratta di una molecola circolare, di un DNA a doppia elica. Che porta? Diciamo 37 geni che codificano per subunità enzimatiche della catena respiratoria, quindi un po. Una parte fondamentale anche per RNA Ribosomiali e transfer. Non ha regioni introniche e ci sono delle diciamo delle differenze rispetto al DNA nucleare. Anche per quanto riguarda il l'utilizzo del codice genetico la terminologia cambia un po perché non si parla di eterozigosi omozigosi, ma ci si riferisce a eteroplasmia quando le. Diciamo la frequenza di questa variante va dal limite di detenzione fino all'omoplasia e poi l'omoplamia che rappresenta invece il il dato in in tutte le molecole. E teniamo sempre presente questa specificità tessutale che rende ancora più complesso il fatto di identificare delle varianti, ad esempio. Ad esempio in sangue periferico rispetto alla biopsia da muscolo. Il sequenziamento del mitocondriale nelle nostre mani con ings short reads funziona molto bene. Riusciamo ad avere un coverage uniforme? La sensitività è alta. E riusciamo ad avere dei diciamo dei limiti abbastanza bassi di di eteroplasmia che ci permettono di identificare varianti anche appunto con con delle frequenze abbastanza basse. Interpretazione clinica rimane 1 1 collo di bottiglia, sicuramente dovuto al al fatto che i dati di popolazione sono limitati, la letteratura è inaccurata o perlomeno parziale, molto spesso anche solo rispetto al ai dati che vengono forniti nel nelle pubblicazioni, rispetto ai livelli di eteroplasmia, per fare un esempio, e poi al fatto che le linee guida per la classificazione siano ancora parziali e quindi ci sia un, diciamo un ritardo rispetto al all'interpretazione. Delle delle varianti nucleari. Quindi perché diciamo che il DNA, diciamo l'inclusione del DNA Mitocondiale nell'esoma possa essere 1 1 test potente diagnostico perché beh, viene eseguito in in parallelo con il nucleare quindi di nuovo la tempistica si accorcia. Siamo in grado di sequenziare il dnamitecondiario intero con un coverage uniforme e di identificare tutti i tipi di varianti, quindi. Siamo in grado di restituire un dato completo rispetto al mitocondrio e abbiamo una elevata profondità di sequenziamento e siamo in grado di andare a identificare varianti anche in bassa eteroplasmia. Sono vorrei perdermi in dettagli tecnici, però essenzialmente, giusto per darvi un'idea, il Read medio è di quasi 10.000 ex e %100% di vasi sequenziate. Siamo intorno ai 1000 ex qui. Anche qui per darvi un'idea sui limiti di di eteroplasmia oltre i quali decidiamo di riportare o non riportare delle varianti. E del 100%, intorno al 5% di Idroplasmia per varianti S and VIS per indel stesso dato. Mentre per 100, ovviamente da. Il dato si fa un po più complesso, quindi l'eteroplasmia raggiunge insomma con livelli di di eteroplasmia 10%, siamo intorno a 99% di sensitività. Quello che abbiamo visto nella nella nostra esperienza è che avere un database in House molto molto vasto, questo perché abbiamo sempre incluso vari anti mitocondriali ormai da da da parecchio tempo, sia nei pannelli sia negli esomi ci permette di. Vedere varianti in molte varianti in in molti pazienti e quindi poi di stabilire quali di queste varianti abbiano effettivamente senso nel contesto del del fenotipo del paziente. Come per il resto delle delle varianti nucleari, siamo in grado di eseguire una review della letteratura molto estensiva ed interpretare poi i dati in base alle linee guida. E alla alla logica che ci guida quotidianamente e. Ed è importante il fatto che classifichiamo in modo sistematico le varianti metocondriali nei pannelli e negli esomi, perché proprio in questa maniera riusciamo a diciamo a escludere molte delle varianti che potrebbero essere classificate come bus quando non c'è. E 1 1 database estensivo quando non non c'è diciamo la possibilità di eseguire. Un'interpretazione così esperta e quindi siamo in grado invece di classificare spesso le varianti come benigne o. Ecco, in in alcuni casi dove invece sarebbero classificate come bus. I motivi per includere un dinamico condeale nell'esoma, insomma, sono sempre legati al fatto di avere fenotipi complessi, avere una diagnosi incerta e presentazioni atipiche. Quindi in un certo senso l'inclusione del mitocondriale non si scosta molto dal dal decidere di fare solo solo l'esoma, però per. La differenza tecnica diciamo di includere anche il mitocondriale. Il vantaggio? È è sicuramente molto grosso, perché. C'è variabilità fenotipica e c'è una complessità diagnostica nelle malattie mitocondiali, quindi spesso il dato poi il risultato che riusciamo a restituire non era atteso, non si sospettava una malattia mitocondriale però. L'aver incluso dena mitocondriale ci ha permesso di arrivare a una diagnosi. Quello che vediamo nel nostro lavoro è che le varianti mitocondiali rappresentano tra l'uno e tre e il 2% di di casi diagnostici. E ci sono diversi, diciamo diversi modi in cui abbiamo visto queste varianti. Essere diagnostiche, quindi essere la unica diagnosi nel 70% dei casi, quindi abbiamo varianti che possiamo classificare come patogeniche o probabilmente patogeniche e sono l'unico risultato diagnostico. Mentre nel 20% dei casi abbiamo visto che le varianti classificate come causative. Vengono trovate insieme ad altre varianti nucleari e quindi contribuiscono al fenotipo. Mentre nel 10% dei casi restanti le varianti sono sì considerate causative, però nel paziente. Nello specifico caso hanno un ruolo incerto e. Oppure c'è già un'altra variante nucleare che spiega il Fenotipo e quindi non si sa bene che cosa, che cosa faccia veramente questa variante mitocondriale nel paziente? Giusto per darvi un'idea sulla nostra esperienza, qui sono elencate alcune delle varianti più. Note sia nella letteratura, ma poi anche nella nostra esperienza, che insomma incontra bene la letteratura. Quindi varianti su TTL One per melas oppure su ITP six per la sindrome di lei EE così via. Abbiamo visto che il range di eteroplasmia può essere indicativo, chiaramente non è l'unica indicazione, ma può essere indicativo per un'associazione con il fenotipo. Quindi. Abbiamo visto che quando l'etroplasmia è tra il 15 e 75% c'è anche una chiara associazione con il fenotipo, inclusi quei casi con una doppia diagnosi, mentre con un range di eteroplasmia inferiore, quindi molto vicino al limite di riportabilità del 5% tra il 5 e il 15. Succedeva anche che l'associazione con il Tenotipo non fosse chiara, quindi c'è 1 1 certa correlazione, questo chiaramente dovuto anche al fatto che spesso. Spesso questa analisi si fa in sangue periferico, quindi i valori in sangue periferico di eteroplasmia non siano molto rappresentativi poi del. Del dei valori nel nel tessuto di interesse. Quindi questo che cosa significa per i pazienti? Possiamo andarlo a vedere con alcuni casi, alcuni casi pratici, bambino di età inferiore ad un anno con epilessia, apnea, radicardia. Era già stato eseguito un pannello per epilessia presso un'altro laboratorio con esito negativo. Quindi abbiamo proceduto con un esomatrio con genitori sani. E non abbiamo identificato nessuna variante nucleare che potesse fornire una diagnosi. Mentre dal dall'analisi del mitocondriale abbiamo trovato 1 1 variante in con enteroplasmi al 55% assente nella madre, quindi consistente con una con un modello de novo variante anche assente nei nelle popolazioni di controllo. Troncante, che rimuove il 23% della proteina già identificata in letteratura in un paziente con sindrome di lei al 21% del sangue periferico, è riportata ad altri lavoratori climber, quindi questo è un caso, diciamo. Non così comune per una per una variante mitocondriale c'è mo già della letteratura è una variante troncante, quindi c'è già c'ha molta evidenza per questa variante. E quello che sappiamo è che. Così come tutte le malattie mitocondiali, i fenotipi sono sono molto variabili. Il il nostro paziente presentava diciamo alcuni dei dei tratti più frequenti, come epilessia o anomalie respiratorie e alcuni tratti invece che sono considerati atipici come cardiomiopatia e i difetti della conduzione. Qui considerato. Considerato molti aspetti, quindi ovviamente l'evidenza in letteratura l'effetto troncante, la frequenza della popolazione, il fatto che fosse putativamente de novo livelli di eteroplasmia adeguati, diciamo per spiegare il fenotipo, è una associazione del gene malattia già già chiara, quindi in questo caso siamo riusciti a dare una risposta chiara al paziente classificando la variante come patogenica. Quindi questo ha portato una conferma molecolare di unapatologialegataalmetocondrialee.it p six con sulle con una diciamo facilitando la consulenza genetica. Poi per il paziente e la famiglia. Allora qui includere il DNA mitocondriale chiaramente ha fatto la differenza, perché altrimenti avremmo perso questa informazione solo guardando il nucleare. Però è chiaro che. Identificare questo tipo di variante richiede una alta sensitività e coverage è 1 1 classificazione, una classificazione adeguata. Secondo caso, invece, è un po più complesso dal punto di vista dell'interpretazione di un giovane adulto che presentava con perdita dell'usi dell'udito, della vista, diabete, anomalie cerebrali confermate sui merai, declino cognitivo, ma una storia familiare non contributiva. Ed erano già stati eseguiti diversi diversi test, probabilmente legati al al cercare di identificare una causa per ognuno di questi sintomi diciamo molto diversi fra loro, quindi un pannello genico neuromuscolare, uno per retinite pigmentosa, sniper array, pannello per diabete e diciamo un un'analisi già mitocondriale in cui una. Variante Puntiforma, era stata trovata il 30% di Iteroplasmia una ed era stata classificata come Wu S, quindi tutti questi risultati precedenti erano non informativi e questo è un classico caso in cui. Appunto, si procede per per step, per diversi motivi e poi si si arriva all'esoma proprio per cercare di avere una visione più più agnostica rispetto al. Alla situazione del paziente, proprio per via di tutti questi sintomi apparentemente non ben correlati. E qui dalle analisi del del nucleare non abbiamo identificato nessuna nessuna variante che potesse spiegare il fenotipo, mentre sul mitocondriale abbiamo identificato due delle lezioni. Al 10% e al 30% di Eteroplasmia. Come nota quella variante mitocondriale che era stata riportata come vs precedentemente, siamo stati in grado di classificarla come benigna proprio per diciamo per l'esperienza su questa variante nel nostro database. Quindi, andando a guardare queste due. Diverse direzioni che abbiamo identificato, beh. Erano, diciamo tra i 5.8 e i 9.5 chilobasi conoscevamo il brakepoint esatti, perché? Come detto, non abbiamo solo un. Uno strumento sviluppato in House per le scienze nucleari ma anche per il mitocondriale, per identificare i Blake points esatti, quindi questo ci ha permesso di trovare le coordinate corrette. Come ho detto diversi livelli di eteroplasmia, però insomma abbastanza simili, molti geni coinvolti per entrambe le entrambe le direzioni che non erano state riportate in precedenza, però per entrambi esistevano delle delezioni simili sovrapposte, quindi questo ci ha ci ha portato AA una classificazione finale per entrambe le le direzioni, come patogeniche. Quindi qui vediamo come nella sindrome da depressione del DNA mitocondriale le caratteristiche cliniche si sovrappongono a diversi tipi di di di sindromi. E come il fenotipo del del paziente. Trovasse poi conferma in in questo tipo di di patologia, quindi retinopatia pigmentaria, il declino cognitivo, la sordità neurosensoriale. Endocrinopatie e l'anomalia riscontrate con merai, in particolare la lesione del Globus Pallidus. Quindi questo è stato un caso di, cioè abbastanza raro rispetto al ad altri findings che abbiamo per quanto riguarda l'identificazione di varianti sul mitocondrio, qui parliamo di di di derezioni, quindi sono un evento più raro rispetto ad altri tipi di varianti però. Sappiamo che sono tipicamente de Novo e quindi anche questo poteva informare una consulenza genetica migliore. Quindi qui per noi ha fatto la differenza essere in grado di avere una analisi bioinformatica custom che ci permette ci permettesse di identificare i vari break points e poi un coverage elevato ed uniforme anche sui mitocondriale, proprio per. Per essere sicuri del dato che andavamo a riportare. Questo invece è un'altro caso di un bambino, un caso pediatrico, un bambino di età inferiore a un anno. In vari sintomi soprattutto. Soprattutto dello sviluppo, abbiamo microcefalia ritardo globale dello sviluppo ipertonia la genesi del corpo calloso, atrofia cerebrale, displasia corticale e questo dato di insomma enerbio ottici piccoli. Erano stati eseguiti dei test genetici in precedenza CMI, che è un pannello genico per migrazione neuronale. Però anche questi negativi c'erano. C'era una storia familiare di aborto, di un feto con microcefalia però cervello normale, e qui abbiamo identificato. Sul DNA nucleare, due varianti già note in questo gene ASNS che. Erano già note per essere appunto causativi, una patogenica, l'altra probabilmente patogenica. Però in questo caso non eravamo in grado di confermare la fase delle varianti, ma si sospettava molto un diciamo la conferma di un deficit di asparagina sintedasi proprio per la presenza di microcefalia congenita al ritardo dello sviluppo e poi diciamo. Diciamo le le caratteristiche identificate su omerai come atrofia cerebrale e corpo caldoso sottile. Però il dato che poi sorprendeva in realtà era quello di aver identificato una variante anche nei mitocondriale, anche questa nota patogenica. È un livello molto alto di. Di frequenza, una variante omoplasmica, quindi. Questa è una variante nota nella neuro patriottica ereditaria di Weber, tra. I vari sintomi associati a questa patologia c'è la disfunzione del nervo ottico che era 1 1 caratteristica di questo paziente. Quindi in questo caso abbiamo identificato due varianti nucleari, probabilmente già. Spiegano una buona buona parte della diagnosi di questo paziente, ma l'aveva identificato anche la diagnosi 1 1 variante mitocondriale di questo tipo sicuramente può informare meglio il management di questo paziente perché le varia, diciamo. Il l'esperienza in questi pazienti con questa variante è che abbiano un esito visivo migliore a lungo termine e che il fenotipo sia meno grave con recupero visivo. Che l'età di insorgenza va dall'età, diciamo dall'adolescenza all'età adulta? Penetra ridotta e associata da progruppi specifici. Quindi questo è un rimane una domanda un po aperta, nel senso che queste sono varianti diagnostiche sia in genoma nucleare sia il mitocondriale, si tratta di una doppia diagnosi. Chiaramente si informa meglio il follow-up oftalmologico e. Speriamo che questo abbia potuto contribuire a una miglior consulenza genetica e poi al management del paziente, che può essere seguito nel tempo non solo con l'idea delle varianti nucleari, quindi di un certo tipo di patologia, ma anche per la presenza della variante MITOCONDIALE importante. Quindi qui ovviamente di nuovo fa la differenza al fatto di aver valutato completamente il. Tutte le varianti presenti nel paziente. Ed essere stati in grado di chiarire la correlazione tra il tra il genotipo e il fenotipo. Quindi siamo arrivati al termine di questa carrellata, diciamo su di alcuni casi, è un po la spiegazione di di quello che che facciamo in a blueprint per esoma EDNA mitocondriale. Qui vedete nella slide i miei colleghi genetisti. Siamo siamo un numero abbastanza numerosi, rappresentiamo una bella fetta del dell'azienda e sono loro ad aver analizzato questi casi che vi ho presentato. Spero le abbiate trovati di di interesse e adesso lascio la parola a fiorula. Credo che. Possiamo aprire la sessione per le domande? Grazie 1000 Diego per la presentazione. Io personalmente ho trovato questi casi molto molto interessanti perché ovviamente è un lavoro molto prezioso da parte del team, sia del laboratorio ma anche dal primo al team dell'interpretazione, poter dare delle risposte, soprattutto anche in quei casi molto complessi dove sia. Apre un la cosiddetta di serie diagnostica, dove si cerca anche di di trovare delle risposte. A maggior ragione anche in questo, in questi periodo storico dove ci sono anche dei trattamenti, ci sono anche a livello le aziende farmaceutiche si stanno muovendo molto. Molto più velocemente in passato per avere determinamenti specifici per diagnosi certe convarianti accertate, per cui a maggior ragione poter dare una conferma diagnostica certa e precisa aiuta anche alla consulenza clinica e al follow up di clinico del paziente. Su. Anche eventualmente. Trattamenti e terapie che possono venire anche negli anni successivi, per cui avere già una diagnosi immediata. Immediata, anche se oggi non dà nessun beneficio subito, potrebbe dare un beneficio a stretto giro. Una domanda che volevo fare io personalmente è, ma potrebbe aver senso nel 2026 continuare a fare l'esoma nonostante il mondo sta andando verso il genoma? Sì. Diciamo che nella nostra. Nella nostra esperienza adesso, ma riesce a risolvere molti casi. Chiaramente il sì, il trend è muoversi verso verso il genoma. Credo che se quello sarà lo standard poi nel diciamo in un futuro non troppo lontano. Però rimane il fatto che il genoma, l'analisi del genoma, è associata a una complessità. Molto superiore rispetto all'esoma e. E ci si pongono anche domande diverse rispetto a ciò che si è in grado di identificare un genoma rispetto rispetto ad un esoma, quindi Io credo che con un esoma ottimizzato di di questo tipo. Quindi andando diciamo AA potenziare l'esoma no rispetto a un a un protocollo standard classico in cui si perdono delle informazioni effettivamente Io credo che in questo caso ottimizzando con questa ricetta anche ho presentato si riesca ad aumentare il il diagnostico in modo importante quindi? Dare delle delle risposte in tempi molto brevi a dei costi ridotti rispetto a un genoma. E andando anche a interpretare le regioni in modo più più puntuale. Perché chiaramente quando si lavora su un genoma si si va poi a aumentare. Anche la complessità dell'interpretazione delle somma è complessa, però rimane a questo punto più semplice rispetto rispetto a un genoma. Quindi dipende dalla domanda che ci si vuole porre però per presentazioni tipiche. Per fenotipi complessi pro. Babilmente. L'esoma è già un è un buon punto di arrivo, non solo di partenza si sente parlare tanto anche di insomma di di un cambio no di paradigma, per cui tipicamente si passa da l'analisi del singolo gene al pannello, poi all'esoma all'Esoma espanso. Quindi sì, forse avrebbe senso in quest'ottica di di progressione verso il genoma, partire con un esoma, questo sì. Quindi questo sì, credo che potrebbe essere 1 1 standard anche in questo senso. Grazie Diego. Potete inserire altri quesiti se ne avete. Nella sessione con Q and Day. Credo di averla chiusa per sbaglio, ma adesso dovrebbe essere aperta prima, scusate. Io non vedo domande. Qui. Se avete curiosità che vi possono venire in mente anche in in un secondo momento, i nostri contatti sono disponibili. Potete raggiungerci sia attraverso il sito sia attraverso il anche sui social. Siamo presenti anche sui social e ai nostri diciamo riferimenti diretti per email. Io vi ringrazio. Di aver partecipato e speriamo di di aver risposto a qualche vostra curiosità e avervi dato dei degli spunti su nuove, diciamo, sfide che si possono presentare. Grazie a tutti, grazie 1000.
